QPNC-PAGE

QPNC-PAGE, of kwantitatieve voorbereidende inheemse continue polyacrylamidegelelektroforese, is een hoge-resolutie-techniek toegepast in de biochemie en Bioanorganische Chemie aparte eiwitten door isoelektrisch punt. Deze gestandaardiseerde variant van natieve gelelektroforese wordt door biologen actieve of natief metalloproteïnen in biologische monsters te isoleren en goed en incorrect gevouwen metaal-cofactor bevattende eiwitten of eiwit isovormen in complexe eiwitmengsels te lossen. De gepresenteerde techniek is gebaseerd op een nieuw principe van gelelektroforese impliceert de nauwkeurige regeling van gel poriegrootte en stabiliteit op het moment van polymerisatie van acrylamide.

Elektroforesebuffer en inrichting

De QPNC-PAGE procedure wordt uitgevoerd in een in de handel verkrijgbaar elektroforese kamer voor het scheiden van geladen biomoleculen. Vanwege de specifieke eigenschappen van de bereide gel en electroforese bufferoplossing, worden de meeste eiwitten van een biologisch systeem negatief geladen in de oplossing en zal zich van de kathode naar de anode als gevolg van het elektrische veld.

Hoewel de pH van de elektroforesebuffer niet overeenkomt met een fysiologische pH-waarde binnen een cel of weefseltype, worden de gescheiden ringvormige eiwitbanden continu geëlueerd in een fysiologische bufferoplossing die in verschillende fracties. De meeste eiwit-moleculen zijn stabiel in waterige oplossing bij pH-waarden van 3 tot 10 als de temperatuur onder 50 ° C. Het scheidingssysteem, waaronder elektroforese kamer en een fractie collector wordt gekoeld in een koelkast.

Gel en gel eigenschappen

De polymerisatietijd van de gel kan direct beïnvloeden de piek-elutietijden van gescheiden metalloproteïnen in het elektroferogram gevolg van de compressie van de gels en de poriën met langere incubatietijden. Om een ​​maximale reproduceerbaarheid gel poriegrootte verzekeren en om een ​​volledig gepolymeriseerd en niet-beperkende grote poriën gel voor een PAGE run verkrijgen, het polyacrylamide gel is gepolymeriseerd gedurende een tijdsperiode van 69 uur bij kamertemperatuur geroerd. Dientengevolge, de bereide gel homogeen is, inherent stabiel en vrij van monomeren of groepen. Verse polyacrylamidegelen verder hydrofiele, elektrisch neutraal en geen eiwitten niet binden.

De 4% T, 2,67% C gel hoofdzaak niet optimaal voor zeven en elektroforese van proteïnen die kleiner en groter dan 200 ku. Eiwitten migreren daarin meer of minder op basis van hun mobiliteit. Daarom interacties van de gel met biomoleculen verwaarloosbaar en de eiwitten gescheiden zuiver en voorspelbaar. De gescheiden metaaleiwitten zijn niet gescheiden in apoproteïnen en metalen co-factoren.

Reproduceerbaarheid en herstel

De bioactieve structuur van de geïsoleerde eiwitmoleculen geen significante conformatieveranderingen ondergaan. Actieve metaal-cofactor bevattende eiwitten kunnen reproduceerbaar worden geïsoleerd in dezelfde fracties na een PAGE run. Een verschuiving piek in de respectieve elektroferogram kan hetzij aangeven dat een gedenatureerde metalloprotein beschikbaar in de originele proteïne mengsel te scheiden of "69 hr rule" gel polymerisatie werd afgebroken. Metaaleiwitten met verschillende moleculaire massa reeksen en iso-elektrische punten zijn teruggevonden in biologisch actieve vorm in een kwantitatieve opbrengst van meer dan 95%.

Kwantificering en identificatie

Lage concentraties van Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr, Cd en andere metalen cofactoren kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd geheel inductief gekoppeld plasma massa spectrometrie, bijvoorbeeld. Vanwege de hoge zuiverheid en optimale concentratie van de afgescheiden metallo bijvoorbeeld therapeutische recombinante plant die geneesmiddelen zoals koper chaperone voor superoxide dismutase uit medicinale planten, in enkele specifieke PAGE fracties, de verwante structuren van deze analyten kunnen worden kwantitatief toegelicht aan gebruik oplossing NMR spectroscopie onder niet-denaturerende omstandigheden.

Toepassingen

Onjuist gevouwen eiwitten metaal, bijvoorbeeld CCS of superoxide dismutase aanwezig in de hersenen, bloed of andere klinische monsters, zijn indicatief voor neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer of amyotrofe laterale sclerose. Actieve CCS of SOD moleculen dragen aan intracellulaire homeostatische van essentiële metaalionen in organismen en dus kunnen deze biomoleculen pro-oxidatieve en antioxidatieve processen evenwicht in het cytoplasma. Momenteel wordt kwantitatief preparatieve natieve PAGE continu toegepast op het gebied van moleculaire biologie enzymen en recombinante eiwitten van microbiële stammen te zuiveren.

Geschiedenis en principe

In de 20e eeuw werd algemeen aangenomen dat ammoniumpersulfaat / TEMED geïnitieerde reacties dienen doorgaan gedurende 2 uur maximale reproduceerbaarheid gel poriegrootte PAGE gels verzekeren. Aldus kan langere incubatietijden geen wezenlijk effect op het eiwit scheidingsproces hebben hoewel restmonomeer blijft na deze periode. Deze standpunten hebben echter fundamenteel veranderd in de afgelopen tijd.

In 2001 is een nieuw basisprincipe van gelelektroforese werd ontdekt bij het Forschungszentrum Jülich. Dit geeft aan dat de tijd van de polymerisatie van een polyacrylamide gel rechtstreeks op het resultaat van eiwitzuivering omdat de scheidingseigenschappen impliceert de mechanische en chemische stabiliteit van de gel en de poriën worden bepaald door deze parameter. Dientengevolge kan de piek-elutietijden impliceert de reproduceerbaarheid en het herstel van de gescheiden eiwitten in het elektroferogram aanzienlijk variëren. Dienovereenkomstig zijn dergelijke procedures leiden tot een verlies van kwaliteit van analytische metingen. Aan de andere kant van de resultaten van eiwit elektroforese in termen van betrouwbaarheid kan worden geoptimaliseerd door een strikte naleving van een gestandaardiseerde tijd van polymerisatie voor PAGE-gels zoals gepostuleerd door Kastenholz en Garfin.

Zei principe als een integraal onderdeel van een nieuwe techniek werd toegepast voor octrooi in 2003, in 2014 uitgegeven en vervolgens gerealiseerd door QPNC-PAGE. Diverse artikelen en protocollen met betrekking tot de toepassingen van QPNC-PAGE werden gepubliceerd van 2006 tot 2012. De meeste van deze publicaties werden bewerkt of co-auteur van de bekende Amerikaanse wetenschapper en internationaal erkend expert op het gebied van eiwit elektroforese David E. Garfin. In de jaren 1970 en de vroege jaren 1980 werd Dr. Garfin een van de belangrijkste onderzoekers en pioniers op het gebied van prion onderzoek in het team van Stanley B. Prusiner. Voor belangrijke bijdragen aan de geschiedenis van de elektroforese Dave Garfin ontving de 2013 AES elektroforese Society Career Award in San Francisco.

(0)
(0)
Commentaren - 0
Geen commentaar

Voeg een reactie

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tekens over: 3000
captcha